賽默飛ABI 7500實時熒光定量PCR儀原理及應用詳解

一、前言

ABI 7500實時熒光定量PCR儀是由Applied Biosystems公司開發并由賽默飛（Thermo Fisher Scientific）整合運營的一款經典qPCR平臺。自推出以來，該儀器憑借其優良的性能表現、穩定的熒光檢測系統、廣泛的適用性與成熟的軟件支持，成為全球科研機構、臨床檢測實驗室以及生物技術企業廣泛使用的分子檢測工具。

ABI 7500以其精確的熒光定量能力、高度自動化的操作界面和靈活的實驗設計支持，已成為實時PCR技術在各類分子生物學實驗中應用的標志性設備之一。

二、基本原理

ABI 7500基于實時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）技術工作，其核心是通過熒光染料或熒光探針實時監控PCR擴增反應中目標核酸的復制情況。熒光信號的強度與擴增產物量直接相關，系統通過監測每個循環中的熒光變化，推算出初始模板濃度。

1. 熒光信號監測

在PCR反應中，熒光信號通常通過以下兩種策略生成：

• 非特異性染料法（如SYBR Green）：與所有雙鏈DNA結合，當擴增產物形成時，熒光強度增強。

• 特異性探針法（如TaqMan探針）：探針結合靶序列，被Taq酶裂解釋放熒光基團，產生特異性信號。

2. Ct值概念

Ct值（Cycle Threshold）指熒光信號首次顯著高于背景的循環數。Ct值越小，表明樣本中靶基因起始拷貝數越多，反之亦然。ABI 7500通過準確測定Ct值，實現對核酸分子的絕對或相對定量分析。

3. 數據計算方法

• 絕對定量：建立標準曲線，以Ct值對應拷貝數。

• 相對定量：利用ΔCt或ΔΔCt方法，計算基因表達量相對于內參基因或參照組的變化倍數。

三、儀器組成與結構功能

ABI 7500主要由四大核心模塊構成，分別負責樣品溫控、熒光采集、系統控制與軟件數據分析：

1. 熱循環模塊

• 樣本容量為96孔標準PCR反應板。

• 加熱模塊采用高導熱金屬材質，溫控準確，升溫速率約為2.5℃/秒，滿足標準PCR程序。

• 溫度均勻性控制在±0.5℃，確保每個孔位反應一致。

2. 熒光檢測系統

• 配備高靈敏度光學采集系統，支持多通道檢測，常見為FAM、VIC、ROX、SYBR、NED等。

• 采用光纖傳輸與CCD成像技術，熒光信號捕捉迅速且精確。

• 可實現多重反應，一孔檢測多個靶標，提高檢測效率。

3. 操作界面與控制模塊

• 控制系統通過計算機操作，兼容Windows操作環境。

• 軟件內置標準操作流程模板，便于快速實驗設置。

• 實驗運行中可實時顯示擴增曲線和熒光變化圖，直觀掌握反應過程。

4. 軟件分析平臺

• ABI 7500配套軟件支持定量分析、溶解曲線分析、基因分型、標準曲線繪制等功能。

• 支持Excel、PDF等格式導出，便于統計分析與文檔歸檔。

• 提供實時質控提示，協助用戶發現反應異常或污染。

四、技術特點與優勢

1. 靈敏度高

ABI 7500可檢測低至個位拷貝的核酸模板，適用于高靈敏度的樣本檢測需求，如病毒載量、殘余DNA檢測、單細胞分析等。

2. 多通道熒光檢測

支持多達5種熒光染料同時運行，能夠實現一孔多靶的多重反應，大幅提升數據通量和實驗效率。

3. 系統穩定性強

儀器在連續高強度運行環境下仍保持擴增一致性，適合臨床實驗室和生物樣本檢測中心的大批量檢測任務。

4. 軟件操作簡便

無需編程基礎即可完成實驗設計，圖形化界面、拖拽式設置，降低使用門檻，適合初學者與經驗用戶。

5. 良好的兼容性

開放式平臺，兼容絕大多數商業化試劑盒與通用耗材，無需專屬配套產品，節省實驗成本。

五、典型應用場景

ABI 7500廣泛應用于科研和臨床領域，主要包括：

1. 基因表達分析

• 通過ΔΔCt方法評估不同處理、組織或時間點間的mRNA表達變化。

• 可用于疾病模型研究、藥物機制分析、基因調控研究等。

2. 病毒核酸檢測

• 適用于各種病毒如HBV、HCV、HIV、SARS-CoV-2等核酸載量的準確測定。

• 常用于醫院、疾控中心的臨床診斷與流行病學研究。

3. 遺傳突變識別

• 配合TaqMan探針，識別SNP、插入缺失突變（INDEL）等遺傳位點。

• 適用于腫瘤分子分型、個體化用藥篩查、遺傳病基因攜帶檢測。

4. 基因分型

• 利用不同熒光探針同時檢測等位基因，進行人群基因型分析。

• 常用于法醫DNA鑒定、親緣關系確認、群體遺傳結構研究。

5. 殘留DNA檢測

• 在生物制藥過程中監測重組細胞殘留核酸，符合GMP質量標準。

六、標準操作流程

ABI 7500的操作流程經過長期優化，保證高重復性與結果穩定性，標準操作流程如下：

第一步：反應體系準備

• 提取DNA或RNA，純化并定量。

• 配制熒光PCR反應液，包括引物、探針或染料、模板等。

第二步：樣品裝板

• 將反應體系分裝至96孔PCR板，封板后輕離心去除氣泡。

第三步：程序設置

• 打開軟件，選擇合適的模板或自定義反應程序與熒光通道。

• 設定反應參數：變性溫度、退火溫度、循環次數等。

第四步：運行實驗

• 插入反應板，啟動程序，儀器自動進行熱循環與熒光監測。

第五步：實時查看與數據分析

• 觀察擴增曲線、熔解曲線（適用于SYBR Green法）判斷反應狀態。

• 分析Ct值，計算表達倍數或載量，輸出定量結果圖表。

七、數據解讀與質量控制

ABI 7500提供多層次數據質量評估機制，幫助用戶判斷反應是否成功：

• 擴增曲線形態：標準S型曲線表明反應正常；斜率過緩或平臺期波動需注意模板質量或反應體系問題。

• 熔解曲線分析：適用于SYBR Green法，單一峰值代表產物特異性好。

• 重復孔間差異：重復Ct值差值應＜0.5，確保擴增一致性。

• 陰陽性對照分析：設置陽性模板與陰性對照以判斷實驗污染或體系失效。

八、維護與使用建議

為了保障ABI 7500長期運行穩定，用戶在使用過程中應注意：

• 定期清潔光路窗口與樣品槽，防止灰塵影響熒光信號。

• 使用高質量封板膜避免蒸發造成熒光漂移。

• 軟件定期更新，保持數據分析模塊最新。

• 避免反應體系混合過程中產生氣泡，影響讀數。

• 實驗后及時導出數據并進行備份存檔。

九、未來發展方向

盡管ABI 7500已被廣泛應用并形成穩定用戶群，但隨著技術演進，實時熒光定量PCR未來仍有以下發展趨勢：

• 多重擴增能力提升：更高通道數、更高光學分辨率。

• 通量升級與自動化聯動：與自動加樣、提取系統對接，實現全流程一體化。

• 便攜化應用拓展：適應現場快速檢測需求，如突發疫情應急檢測。

• AI輔助數據分析：引入機器學習算法優化曲線識別與異常判斷。

• 與數字PCR融合：進一步提升超低豐度靶標的定量能力。

ABI 7500作為經典平臺仍具備拓展潛力，特別是在臨床分子診斷領域，其穩定性與可驗證性是許多實驗室選擇其為主力設備的關鍵因素。

十、結語

賽默飛ABI 7500實時熒光定量PCR儀憑借其堅實的技術基礎、高靈敏度、高通量能力與成熟的軟件平臺，已經成為分子生物學實驗室、醫院檢驗科和生命科學企業不可或缺的重要工具。它不僅為科研人員提供高質量的核酸檢測結果，也為臨床分子診斷奠定了堅實基礎。

無論是進行基因表達研究、病毒核酸檢測，還是執行藥物篩選和遺傳突變分析，ABI 7500都能提供準確、可靠、高效的數據支持。未來，隨著技術迭代升級，其應用邊界將不斷拓展，為分子生物科學的發展持續注入動力。